實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一種在DNA擴增反應中，通過熒光化學物質實時監(jiān)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產物總量的技術，可對特定核酸序列進行定量分析。
 

　　一、檢測原理
 

　　實時熒光定量PCR結合了PCR技術和實時熒光檢測技術，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化。通過Ct值(擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)次數)和標準曲線的分析，對起始模板進行定量分析。
 

　　二、熒光標記物
 

　　實時熒光定量PCR常用的熒光標記物包括熒光探針和熒光染料：
 

　　熒光探針：
 

　　TaqMan熒光探針：在探針的5'端設計有報告基團，3'端設計有淬滅基團。當報告基團接近淬滅基團時，不會檢測到熒光信號。在PCR反應時，寡核苷酸兩個基團分離，即可檢測到熒光信號，并與PCR產物同步。新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變(SNP)。
 

　　分子信標：一種在5'和3'末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。當與核酸靶分子雜交后，構象發(fā)生變化而發(fā)出熒光。
 

　　熒光染料：
 

　　SYBR熒光染料：在PCR反應體系中加入過量SYBR熒光染料，該染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)出熒光信號，未摻入鏈中的SYBR染料分子不發(fā)出任何熒光信號。因此，PCR產物越多，熒光越強，熒光信號的增加與PCR產物的增加同步。SYBR Green法可以用于各種擴增產物的定量，只要最后產物是雙鏈DNA，這既是其主要優(yōu)點，也是主要的缺陷，即不能區(qū)分擴增產物的特異性。
 

　　三、優(yōu)勢
 

　　與普通PCR相比，實時熒光定量PCR具有許多優(yōu)點：
 

　　定量準確：克服了傳統(tǒng)的基于反應產物進行定量的缺陷，避免了酶活性差異對定量結果的影響，使對原始模板的定量更準確，而且結果重現性好，定量范圍寬。
 

　　操作簡便：整個PCR過程可實現自動化，且耗時短，操作方便，不易污染。實時熒光定量PCR在加樣后的過程完成閉管操作，不需要PCR后處理，使該技術更簡單、更快速、操作更安全、假陽性率更低，因此結果更可靠。
 

　　結果直觀：儀器在線式實時檢測，結果直觀，避免人為判斷的失誤，結果數據可長期保存。
 

　　四、用途
 

　　實時熒光定量PCR可應用于多個領域：
 

　　病原體檢測：常用于病毒載量測定，如乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等的定量分析。
 

　　基因表達分析：可比較不同組織或條件下特定基因的轉錄水平差異，研究基因表達的情況，即該基因在不同生理階段的變化趨勢。
 

　　遺傳病診斷：能檢測基因拷貝數變異，如脊髓性肌萎縮癥的SMN1基因缺失。
 

　　腫瘤標志物檢測：如乳腺癌HER2基因擴增分析。
 

　　其他領域：還可用于轉基因成分鑒定、微生物群落定量、法醫(yī)學、群體生物學及免疫學研究等。